بهینه‌سازی رشد باکتری‌های سلولولیتیک جدا شده از دستگاه گوارش اسب و بررسی اثر انتقال آن‌ها به شیرابه شکمبه بر گوارش پذیری کاه گندم

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی دکترا تغذیه دام دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی خوزستان

2 دانشگاه رامین

3 استاد و عضو هیات علمی گروه زیست‌شناسی دانشکده علوم، دانشگاه شهید چمران اهواز عضو هیات علمی مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی و علوم زیستی دانشگاه شهید چمران اهواز

4 دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی رامین خوزستان

5 عضو هیأت علمی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری

چکیده

سابقه و هدف؛ مواد لیگنو سلولزی در جیره نشخوارکنندگان از اهمیت بالایی برخوردار بوده و به دلیل مقرون به صرفه بودن و اثر بر عملکرد بهینه شکمبه و سلامت آن در جیره نشخوارکنندگان گنجانده می‌شوند. گرچه این ترکیبات توسط بسیاری از میکروب‌های شکمبه قابل تخمیر می‌باشند، ولی وجود پروتئین، فیبر و سایر مواد مغذی با منشا خوراکی در مدفوع نشان می‌دهد که اکوسیستم شکمبه برای هضم خوراک خورده شده کارایی بالایی ندارد. بنابراین دستکاری شکمبه جهت بالا بردن این کارایی ضروری به نظر می‌رسد. لذا این پژوهش با هدف بهینه سازی شرایط رشد باکتری‌های سلولولیتیک جدا شده از دستگاه گوارش اسب و اثر انتقال آنها به شیرابه شکمبه بر فراسنجه‌های تولید گاز و گوارش پذیری کاه گندم در شرایط برون تنی انجام پذیرفت.
مواد و روش‌ها؛ این پژوهش در شرایط آزمایشگاهی و در قالب طرح کاملا تصادفی انجام شد. باکتری‌های سلولولیتیک جداشده از دستگاه گوارش اسب شامل Paenibacillus polymyxa L11، Paenibacillus polymyxa L12، Enterobacter cloacae L2 و Escherichia coli Z2 بودند. ابتدا بهینه‌سازی دما و pH برای رشد و تولید آنزیم این باکتری‌ها در دو دمای 25 و 39 درجه سانتی-گراد و سه pH 2/5، 7/5 و 2/6 انجام پذیرفت. سپس با انتقال این باکتری‌ها به شیرابه شکمبه، فرانسجه‌های تولید گاز و قابلیت هضم آزمایشگاهی کاه گندم به ترتیب با استفاده از دو تکنیک تولید گاز و هضم دو مرحله‌ای مورد بررسی قرار گرفتند. به این منظور از چهار راس گوسفند مایع شکمبه گرفته شد، در هر دو تکنیک مایع شکمبه با باکتری‌های مورد نظر تلقیح و با کاه گندم انکوبه گردید.
یافته‌ها: نتایج نشان داد که جدایه Paenibacillus polymyxa L12 بهترین رشد را در دمای 39 درجه سانتی‌گراد و pH 2/5 و بیشترین فعالیت آنزیمی را در دمای 39 درجه با pH 7/5 و در زمان 24 ساعت داشت. دما و pH بهینه برای رشدPaenibacillus polymyxa L11 و Enterobacter cloacae L2 به ترتیب 39 درجه سانتی‌گراد و 2/6 بود. این دو باکتری بیشترین فعالیت آنزیمی را در دمای 39 درجه سانتی‌گراد و pH 2/6 به ترتیب در زمان‌های 24 و 48 ساعت از خود نشان دادند. Escherichia coli Z2 نیز بیشترینگاز کاه گندم، افزایش ماده آلی واقعا هضم شده، افزایش بیومس و راندمان بیومس میکروبی شدند (05/0p <). بیشترین و کمترین پتانسیل گاز تولیدی به ترتیب به تیمار شاهد (79/59 میلی لیتر) و تیمار Z2 (00/52 میلی لیتر) اختصاص داشت. بیشترین و کمترین مقدار ماده آلی واقعا هضم شده به ترتیب مربوط به تیمار L11 (4/284 میلی‌گرم) و تیمار شاهد (1/266 میلی‌گرم) بود. بین ضریب تفکیک، بیومس میکروبی و راندمان بیومس میکروبی تیمار‌های باکتریایی اختلاف معنی‌داری وجود نداشت (05/0P>)، ولی همگی بیشتر از تیمار شاهد بودند. تیمارL11 دارای بالاترین قابلیت هضم ماده خشک (73/50 درصد)، ماده آلی (39/49 درصد)، فیبر نامحلول در شوینده خنثی (69/47 درصد) و اسیدی (55/35 درصد) بود. تیمار شاهد دارای کمترین قابلیت هضم ماده خشک(83/38 درصد)، ماده آلی (76/37 درصد) و فیبر نامحلول در شوینده خنثی (56/34 درصد) بود. ولی بین قابلیت هضم فیبر نامحلول در شوینده اسیدی تیمارهای L12، L2 و Z2 با تیمار شاهد اختلاف معنی‌داری وجود نداشت (05/0P>).
نتیجه گیری: به طور کلی دما وpH بررشد و تولید آنزیم جدایه‌ها تاثیر گذار بود. همه آنها در دمای 39 درجه سانتی‌گراد که دمای مطلوب شکمبه است بهتر ازدمای 25 درجه رشد کرده و فعالیت آنزیمی بیشتری داشتند.این باکتری‌ها توانستند تخمیر شکمبه‌ای و قابلیت هضم مواد مغذی کاه را در شرایط آزمایشگاهی بهبود بخشند. در تیمارهای باکتریایی مسیر تخمیر به سمت تولید گاز کمتر و پروتئین میکروبی بیشتر پیش رفت و قابلیت هضم مواد مغذی در این تیمارها افزایش یافت.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Optimization Growth of isolated Cellulolytic Bacteria from Gastrointestinal Tract of Arabian Horse and Investigation of the effect of transferring to rumen fluid on wheat straw digestibility

نویسندگان [English]

  • Maryam Harsini 1
  • hosein Motamedi 3
  • Mohsen Sari 4
  • Asadolah Teimouri Yansar 5
1 Agricultural Sciences and Natural Resources University of Khuzestan
3 Department of Biology, Faculty of Science, Shahid Chamran University of Ahvaz, P.O. Box 61357-43169, Khuzestan, Iran. 2Biotechnology and Biological Science Research Center, Shahid Chamran University of Ahvaz, P.O. Box 61357-43169, Khuzestan, Iran.
4 Agricultural Sciences and Natural Resources University of Khuzestan
5 Department of Animal Sciences, Sari Agricultural Sciences and Natural Resources University
چکیده [English]

Background and Objectives: Lignocellulosic material is important in ruminant rations and because of its cost-effectiveness and effect on optimum rumen performance and its health included in ruminant rations. Although these compounds can be fermentable by many rumen microbes, the presence of proteins, fibers and other edible source nutrients in the feces shows that the rumen ecosystem does not have high efficacy for digestion. Thats way, it seems necessary, the manipulation of the rumen to increase of this performance. Therefore, this study was carried out with the aim of the Investigation of optimization growth of cellulolytic bacteria isolated from gastrointestinal tract of Arabian horse and the effect of transferring to the rumen fluid on the in vitro parameters of gas production and digestibility of wheat straw.
Materials and Methods: This research was conducted in vitro based on a completely randomized design. The cellulolytic bacteria isolated from the gastrointestinal tract include Paenibacillus polymyxa L11, Paenibacillus polymyxa L12, Enterobacter cloacae L2, and Escherichia coli Z2. At first, optimization of temperature and pH for growth and production of the enzymes of these bacteria was carried out at two temperatures of 25 and 39 ° C and three pHs of 2.5, 7.5 and 6.2. In the next step, these bacteria were transferred to the rumen fluid and gas production parameters and in vitro digestibility of wheat straw were investigated using gas production techniques and two step digestion, respectively. For this purpose, rumen fluid was taken from four sheep. In both methods, rumen fluid was inoculated with bacteria and incubated with wheat straw.
Results: The results showed that Paenibacillus polymyxa L12 had the best growth at 39 ° C and pH 5.2 and had the highest enzyme activity at 39 ° C, pH 5.7 and 24 hours. The optimum temperature and pH for growth of Paenibacillus polymyxa L11 and Enterobacter cloacae L2 were 39 ° C and 6.2. These two bacteria exhibited the highest enzymatic activity at 39° C and pH 6.2, at 24 and 48 hours, respectively. Escherichia coli Z2 showed the highest growth at 39 ° C and pH 6.2, but the most enzymatic activity of this bacterium was 39 ° C, pH 5.2 and 48 hours. The isolates reduced the gas production of wheat straw, increased truly degraded organic matter, microbial biomass and microbial biomass efficiency (p < 0.05). The highest and lowest potential of gas production was allocated to control and Z2 treatments, respectively. The lowest and highest amount of truly degraded organic matter was related to the control and L11 treatment, respectively. There was no significant difference between partitioning factor, microbial biomass and microbial biomass efficiency of bacterial treatments (P> 0.05), but they were metergent fiber. The control had the least digestibility of dry matter, organic matter and neutral detergent fiber. There was no significant difference for digestibility of acid detergent fiber among L12, L2 and Z2 treatments and control (P> 0.05).
Conclusion: Generally, temperature and pH had an effect on the growth and production of enzymes of isolates. All isolates grew at a temperature of 39 ° C, which is the optimal temperature of the rumen, better than 25 ° C and had more enzymatic activity at 39 ° C. These bacteria were able to improve rumen fermentation and in vitro digestibility of wheat straw. In the bacterial treatments, the fermentation pathway went towards producing less gas and more microbial protein, and the digestibility of nutrients in these treatments increased.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Cellulolytic bacteria
  • horse
  • fermentation
  • digestibility
  • Wheat straw
 Alvarez, G., Pinos-Rodríguez, J.M., Herrera, J.G., García, J.C., Gonzalez, S.S., and Barcena, R. 2009. Effects of exogenous fibrolytic enzymes on ruminal digestibility in steers fed high fiber rations. Livest. Sci. 121: 150-154.‏
AOAC. 1990. Association of Official Analytical Chemists, Official Methods of Analysis, 15th ed. AOAC, Arlington, VA, USA.
Attwood, G.T., Lockington, R.A., Xue, G. P., and Brooker, J.D. 1988. Use of a unique gene sequence as a probe to enumerate a strain of Bacteroides ruminicola introduced into the rumen. Appl. Environ. Microbiol. 54(2): 534-539.‏
Azizi, A., Mohammadabadi, T., Motamedi, H., Chaji, M., and Fazaeli, H. 2016. Effect of transferring lignin and lignocellulose-degrading bacteria of termite gut to the rumen fluid on in vitro gas production parameters and digestibility of wheat straw and date liaf. Anim. Sci. J. (pajouhesh & sazandegi). 114: 219-230. (In Persian)
Balamurugan, A., Jayanthi, R., Nepolean, P., Pallavi, R.V., and Premkumar, R. 2011. Studies on cellulose degrading bacteria in tea garden soils.Afr. J. Plant Sci.5(1): 22-27.‏
Beard, C.E., Hefford, M.A., Forster, R.J., Sontakke, S., Teather, R. M., and Gregg, K. 1995. A stable and efficient transformation system for Butyrivibrio fibrisolvens OB156. Curr. Microbiol. 30(2): 105-109.‏
Bholay, A.D., Gaur, A., Ganeshan, M., and Shah, R. 2014. Exploration of cellulolytic potential of Termite gut flora for sustainable development. J. Environ. Sci. Toxicol. Food Technol. 8(2): 71-76.‏
Clark, R.G., Cheng, K.J., Selinger, L.B., and Hynes, M.F. 1994. A conjugative transfer system for the rumen bacterium, Butyrivibrio fibrisolvens, based on Tn916-mediated transfer of the Staphylococcus aureus plasmid pUB110. Plasmid. 32(3): 295-305.‏
Coleman, G.S., and Hall, F.J. 1984. The uptake and utilization of Entodinium caudatum, bacteria, free amino acids and glucose by the rumen ciliate Entodinium bursa. J. Appl. Bacteriol. 56(2): 283-294.‏
Coleman, G.S., and Sandford, D.C. 1979. The uptake and utilization of bacteria, amino acids and nucleic acid components by the rumen ciliate Eudiplodinium maggii. J. Appl. Bacteriol. 47(3): 409-419.‏
Cotta, M.A., Whitehead, T.R., and Rasmussen, M.A. 1997. Survival of the recombinant Bacteroides thetaiotaomicron strain BTX in in vitro rumen incubations. J. Appl. Microbiol. 82(6): 743-750.‏
Dawson, K.A. 1993. Probiotics and enzymes in ruminant nutrition. In Enzymes in Animal Nutrition, Proceedings of the 1st Symposium. Kartause Ittingen, Switzerland. 89-96.‏
Fon, F. N., Nsahlai, I.V., and Scogings, P.F. 2014. Extraction and comparison of fibrolytic enzyme additives from gut of 11 ungulates. Afr. J. Biochem. Res.8(2): 31-38.‏
Gobius, K.S., Xue, G.P., Aylward, J.H., Dalrymple, B.P., Swadling, Y.J., McSweeney, C.S., and Krause, D.O. 2002. Transformation and expression of an anaerobic fungal xylanase in several strains of the rumen bacterium Butyrivibrio fibrisolvens. J. Appl. Microbiol. 93(1): 122-133.‏
Harsini Shakarami, M., Mohammadabadi, T., Motamedi, H., Sari, M., and Teimouri Yansari, A. 2019. Isolation and identification of cellulolytic bacteria from gastrointestinal tract of Arabian horse and investigation of their effect on the nutritional value of wheat straw. J. Appl. Microbiol. 1-10.
Hatef, H., Sarvari, A.A., Daneshvar, M., and Sadrolashraf, M. 2007. The determine of milk price and milk production breakeven level (Khorasan province case study). 6th National Conference of Agricultural Economics. Ferdowsi University of Mashhad, Iran. (In Persian)
Hungate, R.E. 1966. The rumen and its microbes. Academic press, New York.
Krause, D.O., Bunch, R.J., Conlan, L.L., Kennedy, P.M., Smith, W.J., Mackie, R.I., and McSweeney, C.S. 2001. Repeated ruminal dosing of Ruminococcus spp. does not result in persistence, but changes in other microbial populations occur that can be measured with quantitative 16S-rRNA-based probes. Microbiology.147(7): 1719-1729.‏
Krause, D.O., Denman, S.E., Mackie, R.I., Morrison, M., Rae, A.L., Attwood, G.T., and McSweeney, C.S. 2003. Opportunities to improve fiber degradation in the rumen: microbiology, ecology, and genomics. FEMS Microbiol. Rev. 27(5): 663-693.‏
Kumar, D., Ashfaque, M., Muthukumar, M., Singh, M., and Garg, N. 2012. Production and characterization of carboxymethyl cellulase from Paenibacillus polymyxa using mango peel as substrate. J. Environ. Biol. 33(1): 81-84.
Kumar, K., Chaudhary, L.C., Agarwal, N., and Kamra, D.N. 2014. Effect of feeding tannin degrading bacterial culture (S treptococcus gallolyticus strain TDGB 406) on nutrient utilization, urinary purine derivatives and growth performance of goats fed on Q uercus semicarpifolia leaves. Anim. Physiol. Anim. Nut. 98(5): 879-885.‏
Liang, Y.L., Zhang, Z., Wu, M., Wu,Y. and Feng, J.X. 2014. Isolation, screening, and identification of cellulolytic bacteria from natural reserves in the subtropical region of China and optimization of cellulase production by Paenibacillus terrae ME27-1. Biomed Res Int.‏
Menke, K.H. and Steingass, H. 1988. Estimation of the energetic feed value obtained from chemical analysis and gas production using rumen fluid. Anim. Res. Dev. 28: 7–55.
Miyagi, T., Kaneichi, K., Aminov, R.I., Kobayashi, Y., Sakka, K., Hoshino, S., and Ohmiya, K. 1995. Enumeration of transconjugated Ruminococcus albus and its survival in the goat rumen ecosystem. Appl. Environ. Microbiol. 61: 2030-2032.
Mohammadabadi, T., Shakarami, M. H., Elghandour, M. M., Salem, A. Z., and Monroy, J.C. 2018. Effect of Natuzyme enzyme on fecal digestion and fermentation of wheat straw and alfalfa hay in Arabian horsesJ. Equine Vet. Sci. 70: 13-17.‏
Newbold, C.J., Wallace, R.J., and McIntosh, F. M. 1996. Mode of action of the yeast Saccharomyces cerevisiae as a feed additive for ruminants. Br. J. Nut. 76(2): 249-261.‏
Ørskov, E.R., and McDonald, I.M. 1979. The estimation of protein degradability in the rumen from incubation measurements weighted according to rate of passage. J. Agric. Sci. (Cambrige). 92: 499-503.
Rasi, R.M., and Mahalingam, P.U. 2012. Screening and Partial Characterization of Cellulose Degrading Bacteria from Decayed Sawdust.‏ Int. J. Sci. Res. 3(8): 328-331.
Sahu, N.P., Kamra, D.N., and Paul, S.S. 2004. Effect of cellulose degrading bacteria isolated from wild and domestic ruminants on in vitro dry matter digestibility of feed and enzyme production. Asian-australas. J. Anim. Sci. 17(2): 199-202.
Sethi, S., Datta, A., Gupta, B. L., and Gupta, S. 2013. Optimization of cellulase production from bacteria isolated from soil. ISRN Biotechnol.
Shinde, V. S., Agrawal, T., and Kotasthane, A. S. 2017. Molecular Characterization of Cellulolytic Bacteria Derived From Termite Gut and Optimization of Cellulase Production. Int. J. Curr. Microbiol. App. Sci. 6(10): 2474-2492.‏
Shoemaker, N.B., Anderson, K.L., Smithson, S. L., Wang, G.R., and Salyers, A.A. 1991. Conjugal transfer of a shuttle vector from the human colonic anaerobe Bacteroides uniformis to the ruminal anaerobe Prevotella (Bacteroides) ruminicola B (1) 4. Appl. Environ. Microbiol.57(8): 2114-2120.‏
Tilley, J.M.A., and Terry, R.A. 1963. A two stage technique for the in vitro digestion of forage crops. J. Br. Grassl. Soc. 18: 104–111.
Van Soest, P.J., Robertson, J.B., and Lewis, B.A. 1991. Methods for dietary fiber, neutral detergent fiber and nonstarch polysaccharides in relation to animal nutrition. J. Dairy. Sci. 74: 3583–3597.
Waeonukul, R., Kyu, K.L., Sakka, K., and Ratanakhanokchai, K. 2009. Isolation and characterization of a multienzyme complex (cellulosome) of the Paenibacillus curdlanolyticus B-6 grown on Avicel under aerobic conditions. J. Biosci. Bioeng. 107(6): 610-614.‏
Wallace, R.J., and Walker, N.D. 1993. Isolation and attempted introduction of sugar alcohol-utilizing bacteria in the sheep rumen. J. Appl. Bacteriol. 74: 353-359.
Whitehead, T.R. 1992. Genetic transformation of the ruminal bacteria Butyrivibrio fibrisolvens and Streptococcus bovis by electroporation. Lett. Appl. Microbiol. 15(5): 186-189.‏
Yang, W., Meng, F., Peng, J., Han, P., Fang, F., Ma, L., and Cao, B. 2014. Isolation and identification of a cellulolytic bacterium from the Tibetan pig's intestine and investigation of its cellulase production. Electron. J. Biotechnol. 17(6): 262-267.‏
Yoon, J.H., Oh, H.M., Yoon, B.D., Kang, K.H., and Park, Y.H. 2003. Paenibacillus kribbensis sp. nov. and Paenibacillus terrae sp. nov., bioflocculants for efficient harvesting of algal cells. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 53(1): 295-301.‏
Ziemer, C. J., Sharp, R., Stern, M.D., Cotta, M.A., Whitehead, T.R., and Stahl, D.A. 2002. Persistence and functional impact of a microbial inoculant on native microbial community structure, nutrient digestion and fermentation characteristics in a rumen model. Syst. Appl. Microbiol. 25(3): 416-422.‏