دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان نشریه پژوهش‌ در نشخوار کنندگان 2345-4253 8 4 2021 03 20 The Effect of microsatellite number and motif type on estimation of population parameters in genetic diversity studies i تاثیر تعداد و نوع نشانگرهای ریزماهواره بر برآورد پارامترهای جمعیتی در مطالعات تنوع ژنتیکی 39 54 5445 10.22069/ejrr.2021.17558.1732 FA منا هاشمی دانشجو دکتری ، گروه ژنتیک و اصلاح نژاد دام، دانشکده علوم دامی وشیلات، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری قدرت رحیمی میانجی استاد ، گروه ژنتیک و اصلاح نژاد دام، دانشکده علوم دامی وشیلات، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری محمد حسین بنابازی استادیار پژوهشی ، بخش پژوهش‌های بیوتکنولوژی، موسسه تحقیقات علوم دامی کشور، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، کرج، ایران، پابلو اوروزکو ترونگل استاد ارشد علوم زیستی، دانشگاه کاردیف، ولز فیلیپو بیسکارینی محقق ارشد، شورای تحقیقات ملی (CNR) ایتالیا Journal Article 2020 01 26 Background and objective:<br />Microsatellites are repetitive regions in DNA including homogeneous array of mono, di, tri, tetra, penta and hexa nucleotides with length of less than 1 Kbp which are non-randomly distributed in genome. The number and density of microsatellites is vary within species even in very close spices such as humans and chimpanzees. The frequency of microsatellite motifs and their mutation rate is reported differently in various organisms. In mammalian genomes di-nucleotide microsatellites are the more abundant type following by mono and tetra microsatellite motifs as next. Tri microsatellites are more frequent in plants. However, the effect of variety in microsatellite motifs on genetic diversity or population structural parameters is a topic that has received less attention. <br />Material and methods<br />In the present study with using the 36 VCf file of microsatellite markers extracted from whole genome of Iranian sheep “Ovis aries and Ovis orientalis” by NGS, the total number of 163973 microsatellite markers were detected. The distribution of Ovis aries samples is from north-west part of Iran and ovis orientalis samples are belongs to central part and north-west of Iran. After rearrangement and filtration on data file using Samtools and VCFtools softwares, we classified the whole markers on four different motif types including di- tri- and tetra-nucleotide microsatellites and a file includes all three microsatellite types. Several subsets including 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400 and 500 markers were generated from each microsatellite motif types using a R script. Six common genetic diversity parameters including observed and expected heterozygosity, Nei diversity index, Shanon index, Allelic richness and FIS were calculated for each different subset of number and motif type of microsatellites in MSA (V.4.05) software. 10 replications were considered for each parameter. The mean and variance were calculated among 10 replications and results were represented by boxplots using R (v.3.3.3). The statistical investigation of parameter estimation differences using different microsatellite number and motif types were analyzed using ANOVA for testing the hypothesis of equality of means in R (v.3.3.3).<br />Results<br />Estimation of all six parameters revealed various results using different number of loci as well as motif types. Additionally, the results revealed higher values for parameters estimated with di microsatellite motifs compared to others. In addition, the highest and lowest value for most parameters were obtained by 40-di and 10-tri/tetra microsatellites respectively. The statistical significance on findings of parameter values using different number/motif of microsatellite markers were analyzed using ANOVA in R (v.3.3.3). In the case with significant results, Tukey Honestly Significant Difference test was used to test pairwise contrasts between different subsets. <br />Conclusion<br />Our result proposes a better application of di microsatellites for genetic diversity studies in sheep populations. Moreover, results showed that for stable estimation of population parameters in genetic diversity studies a minimum of 50 microsatellite loci are needed. سابقه و هدف<br />ریزماهواره‌ها نواحی تکراری در دی.ان.آشامل آرایه‌های همگنی از موتیف‌های مونو، دی، تری، تترا، پنتا و هگزا نوکلئوتیدی با طول کمتر از یک کیلو جفت باز هستند که به صورت غیر تصادفی در سطح ژنوم پراکنده‌اند. تعداد و تراکم ریزماهواره‌ها در گونه‌های مختلف متفاوت است. حتی در گونه های بسیار نزدیک به هم مثل انسان و شامپانزه نیز تفاوت هایی وجود دارد. فراوانی موتیف‌های ریزماهواره‌ایی نیز در موجودات مختلف، متفاوت و دارای نرخ جهش متفاوتی می‌باشند. در ژنوم پستانداران، ریزماهواره‌های دی نوکلئوتیدی فراوانترین و پس از آنها ریزماهواره های مونو و تترا نوکلئوتیدی از وفور بالایی برخوردارند. تکرارهای تری نوکلئوتیدی معمولاً در گیاهان فراوان‌تر هستند. اما بررسی اثراین موتیف‌های ریزماهواره‌ای متفاوت روی برآورد پارامترهای تنوع ژنتیکی و یا ساختار ژنتیکی در جمعیت‌ها بحثی است که کمتر به آن توجه شده است.<br />مواد و روش‌ها<br />این پژوهش با استفاده از فایل نشانگرهای ریزماهواره‌ای حاصل از 36 نمونه از گوسفندان اهلی و وحشی ایرانی از توالی کل ژنوم گوسفندان به روش توالی یابی نسل جدید، تعداد 163973 نشانگر ریزماهواره را شناسایی شد. پراکنش نمونه های اهلی مربوط به نواحی شمال غرب کشور و نمونه های وحشی مربوط به نواحی مرکزی و شمال غرب کشور می باشند. پس از طی مراحل مختلف جهت مرتب سازی و فیلتراسیون جایگاه‌ها در نرم افزارهای Samtools و VCFtools نشانگرها در چهار فایل جداگانه شامل نشانگرهای دی، تری و تترا نوکلئوتیدی و نیز فایلی حاوی ترکیبی از هرسه نشانگر دسته بندی شدند. سپس اسکریپتی در نرم افزار R جهت تهیه زیرمجموعه‌های مختلفی شامل10، 20، 30، 40، 50، 60، 70، 80، 90، 100، 150، 200، 250، 300، 400 و 500 نشانگر از هر یک از انواع موتیف‌ها تهیه نوشته شد و شش پارامتر معمول مورد استفاده در مطالعات تنوع ژنتیکی از جمله هتروزیگوسیته مشاهده شده، هتروزیگوسیته مورد انتظار، شاخص تنوع ئنی، شاخص شانون، غنای آللی و ضریب همخونی با استفاده از هر یک از انواع موتیف‌ها و تعداد مختلفی از ریزماهواره‌ها در نرم افزار MSA (نسخه 4.05) محاسبه شد. برای هر پارامتر 10 تکرار در نظر گرفته شد. در نهایت میانگین و واریانس هر پارامتر در بین 10 تکرار محاسبه و نتایج به صورت نمودارهای باکس پلات در نرم افزار R (نسخه 3.3.3 ) گزارش شد. برای بررسی آماری اختلاف‌هایی که در مقدار برآورد پارامترهای مختلف با استفاده از تعداد و انواع مختلف موتیف‌های ریزماهواره‌ای مشاهده شد، از روش تحلیل واریانس برای آزمون فرض مقایسه میانگین زیرمجموعه‌های مختلف در نرم افزار R استفاده شد.<br />یافته‌ها<br />برآورد شش پارامتر با استفاده از تعداد و موتیف‌های مختلف نشانگرهای ریزماهواره‌ایی نتایج متفاوتی را نشان دادند. به طوریکه در هر زیر مجموعه، پارامتر برآورده شده با استفاده از موتیف‌های نوع دی مقدار عددی بالاتری را به خود اختصاص داد. همینطور در اکثر پارامتر‌های مورد بررسی بیشترین مقدار برآورده شده برای آن پارامتر با استفاده از 40 نشانگر دی نوکلئوتیدی و کمترین آن با استفاده از 10 نشانگر تری و یا تترا نوکلئوتیدی به دست آمده است. برای بررسی وجود اختلاف معنی دار در نتایج به دست آمده از برآورد پارامترها با استفاده از تعداد و انواع مختلف موتیف‌های ریزماهواره‌ای از تکنیک آنالیز واریانس برای مقایسه میانگین‌ها استفاده شد. در مواردی که اجرای مدل نتایج معنی داری نشان داد به منظور بررسی دوبه‌دوی زیرمجموعه‌هایی که با یکدیگر اختلاف معنی دار نشان دادند از روش مقایسه میانگین توکی استفاده شد.<br />نتیجه گیری<br />نتایج این پژوهش برتری استفاده از موتیف های نوع دی نوکلئوتیدی در مطالعات تنوع ژنتیکی بر جمعیت‌ گوسفند را نشان داد. همینطور نتایج این پژوهش لزوم استفاده از حداقل 50 جایگاه ریزماهوره‌ای را برای داشتن برآوردهایی باثبات از پارامترهای جمعیتی در مطالعات تنوع ژنتیکی پیشنهاد میدهد https://ejrr.gau.ac.ir/article_5445_8682ac3a0aa93f6183e27d6aaa19ed0b.pdf